scRNA-seq ile TCR verilerini birleştirmekte takıldım, klonal çeşitliliği nasıl doğru çıkarabilirim?

Reis selamlar, bu konuyu çok iyi yerdedin çünkü aslında mesele tek bir tool’da değil, iki veri kaynağını doğru hizalamada. İşin özünü anlatayım.

İlk olarak CellRanger VDJ’ye takılma sebebin mantıklı ama genelde sorun ondan çok ‘consensus assembly’ kalitesinde oluyor. V(D)J assembly’de soft-assembly modunu açmanı öneririm, özellikle low-quality hücrelerde full-length transcript’ları kurtarabiliyor. Ama asıl kritik nokta: receptor dizilerini hücrelere atarken mutlaka multiome pipeline’ını (10x’inkinde multiome olarak işaretli) kullan, çünkü TCR barındıran hücreler transkriptomda genelde düşük depth’te okunur, single-mode’da bu hücreler filtrelenip düşebilir.

Klonal gruplama kısmına gelirsek: CRISPR/VDJ alignment sonrası hücreleri klon olarak tanımlarken sadece V-J eşleşmesine bakma, CDR3 dizisinin tam eşliğini (identity %95+) şart koy. Aynı V-J farklı CDR3 = farklı klon. CDR3’ü hash’leyip Frequency of Clones (FC) hesabını yaptıktan sonra Shannon entropy ya da Simpson indeksiyle diversity skoru çıkarabilirsin, klonal evenness’i numeric olarak okumana yarar.

Benim iş akışım şöyle: CellRanger multiome -> Louvain clustering -> sonra Python tarafında scanpy ile CDR3’leri hücre metadata’sına bindirip Leiden cluster’larında klon frekanslarını çıkarıyorum. Klonal genişleme göstermek istersen tsne/umap üzerine her klonu renklendirip görselleştirme en ikna edicisi oluyor.

İşin sinyal işlenme kısmına (TCR processing) gelirsek, burada receptor ekpresyonuyla beraber ilgili genlerin (ör. aktivasyon/efektor marker’ları) korelasyonuna bakman lazım. Klonal zenginlikle birlikte bu marker’ların ekspresyon profiline bakarak hangi klonların aktif, hangilerinin memory/exhausted yönüne evrildiğini çıkarabiliyorsun. Bu arada batch effect’e dikkat, birden fazla numune varsa Harmony ya da Seurat integration ile düzelt, yoksa klon ‘çeşitliliği’ olarak göründükleri şey aslında teknik artifact çıkabiliyor.

Veri setin ne kadar büyük? Hücre sayısı belli olunca tam pipeline kurulumunu da adım adım atabilirim.